**印跡檢測(cè)法（Western blotting）,又稱蛋白質(zhì)印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和**遺傳學(xué)等生命科學(xué)研究中常用的的一種實(shí)驗(yàn)方法，其基本原理是通過 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分待測(cè)樣品不同的組分，再在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上，通過特異性抗體作為探針，對(duì)靶抗原蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，通過分析特異性反應(yīng)的位置和強(qiáng)度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或（和）組織中表達(dá)情況的信息。
一、 基本原理 Western blotting 實(shí)驗(yàn)通常由 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白質(zhì)的印跡和檢測(cè)兩個(gè)部分組
成。
**部分：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳
1、 蛋白質(zhì)的電泳分離是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下,向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)的現(xiàn)象，各種蛋白質(zhì)因所帶的凈電荷、分子量大小和形狀不同而有不同的遷移率。聚丙烯酰胺凝膠（PAG）是由丙烯酰胺單體（Acr）和交聯(lián)劑****丙烯酰胺（Bis）在催化劑過硫酸銨作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。如果在電泳體系加入十二烷基硫酸鈉（SDS），則電泳遷移率主要依賴于分子量，與所帶的凈電荷和形狀無關(guān)。這種電泳方法稱為 SDS-PAGE，主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)亞基分子量。
2、 電泳啟動(dòng)后，蛋白樣品先在濃縮膠中運(yùn)動(dòng)，由于濃縮膠孔徑大，蛋白質(zhì)運(yùn)動(dòng)受阻小，因此不同的蛋白質(zhì)就濃縮到分離膠之上層，全部蛋白質(zhì)處于同一起跑線上。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入分離膠時(shí)，因單位質(zhì)量帶負(fù)電荷多者遷移快，反之則慢，即分子量小的蛋白遷移快，分子量大的蛋白遷移慢；由于分離膠孔徑小，而且成為一個(gè)整體的篩狀結(jié)構(gòu)，它們對(duì)大分子阻力大，小分子阻力小，因而蛋白質(zhì)在電泳過程中*終達(dá)到彼此分開。
3、 由于凝膠濃度不同，平均孔徑不同，能通過的可移動(dòng)樣品蛋白質(zhì)的分子量也不同。選擇一定的凝膠濃度，即選擇合適的凝膠孔徑，可使待分離樣品蛋白質(zhì)的泳動(dòng)速率差異*大，得到*佳分離效果。通常根據(jù)被分離蛋白質(zhì)的分子量范圍選擇凝膠濃度
**部分：蛋白質(zhì)的印跡和檢測(cè)蛋白質(zhì)的印跡和檢測(cè)包括五個(gè)步驟：
轉(zhuǎn)膜→封閉→孵育一抗→孵育二抗→蛋白檢測(cè)（顯色）和分析
1、 轉(zhuǎn)膜蛋白質(zhì)印跡首先是要將電泳后分離的蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相載體（膜）上，
即轉(zhuǎn)膜。*常用的固相載體（膜）主要是硝酸纖維素（NC）膜和聚偏二氟乙烯（PVDF）
膜。硝酸纖維素（NC）膜與蛋白質(zhì)之間靠疏水作用結(jié)合，無需預(yù)先活化，對(duì)蛋白質(zhì)的活性影響小；非特異性本底顯色淺；價(jià)格低廉，使用方便。但結(jié)合在NC 上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時(shí)易丟失；NC韌性較差，易損壞。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜與蛋白質(zhì)
親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的NC膜。因?yàn)殡S著膜孔徑的不斷減小，膜對(duì)低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用0.45 μ m 和0.2 μ m 兩種規(guī)格的NC 膜。大于20 KD 的蛋白可用0.45 μ m 的膜，小于20 KD 的蛋白就要用0.2μ m 的膜。PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分 子量蛋白的檢測(cè)。 常用的轉(zhuǎn)膜方式分為半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)兩種。 半干轉(zhuǎn)即將裝有凝膠、膜和濾紙的“三明治”的凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因?yàn)殡娏髦苯幼饔迷谀ず湍z上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴(yán)格，但其轉(zhuǎn)移時(shí)間短，效率高。 濕轉(zhuǎn)即將裝有凝膠、膜和濾紙的“三明治”的凝膠夾層組合卡在轉(zhuǎn)移槽內(nèi)，垂直懸浮在緩沖液中，利用與凝膠夾層平行的電極板的高強(qiáng)度電場(chǎng)將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至膜上。其優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行有效轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移時(shí)間可適當(dāng)延長獲得更完全的轉(zhuǎn)移，且可以同時(shí)轉(zhuǎn)移幾塊膠的蛋白質(zhì)。
2、	封閉 轉(zhuǎn)移成功后的膜上有很多非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，為防止這些位點(diǎn)與抗體結(jié)合引起非特異的染色和背景，一般用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點(diǎn)來降低抗體的非特異性結(jié)合。封閉劑應(yīng)該封閉所有未結(jié)合位點(diǎn)而不替換膜上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白的表位，也不與抗體或檢測(cè)試劑有交叉反應(yīng)。*常見的封閉劑是BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠和Tween-20，緩沖溶液是TBS或PBS。 惰性蛋白質(zhì)BSA、脫脂奶粉、酪蛋白、明膠或非離子去污劑Tween-20封閉膜上的未結(jié)合位點(diǎn)可以降低抗體的非特異性結(jié)合。Tween-20這種非離子型去污劑在乳化蛋白時(shí)，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，可減少對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞。 封閉劑選擇： a 脫脂奶是*常用的經(jīng)濟(jì)配方 b 脫脂奶粉不能與生物素化的抗體一起使用，因?yàn)槊撝谭酆刑堑鞍缀蜕锼?；建議使用BSA。 c 分析磷酸化蛋白須用BSA。脫脂奶粉含磷酸酶，用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白受到影響，因?yàn)榱姿崦概c膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化;也不適用于堿性磷酸酶(AP)檢測(cè)系統(tǒng)。 d 如果用辣根過氧化物酶(HRP)檢測(cè)系統(tǒng)，封閉液不應(yīng)加疊氮鈉(NaN3)，因?yàn)榀B氮鈉對(duì)辣根過氧化物酶（HRP）有滅活作用。 e 如果用二抗抗體是堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的檢測(cè)系統(tǒng)，可使用酪蛋白封閉，同時(shí)須選擇TBS緩沖溶液，不可使用PBS緩沖溶液，因?yàn)镻BS緩沖溶液干擾堿性磷酸酶。 3、 孵育一抗檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)的特異性一抗抗體和封閉后的膜進(jìn)行孵育，膜上的目標(biāo)蛋白質(zhì)和一 抗抗體發(fā)生特異性的結(jié)合。 在**印跡實(shí)驗(yàn)中，一抗抗體應(yīng)該提前選定。一抗抗體取決于被檢測(cè)的抗原蛋白質(zhì)。**印跡一抗抗體包含單克隆抗體(MAbs)和多克隆抗體(PAbs)。單克隆抗體(MAbs)識(shí)別單個(gè)抗原表位,具有更高的特異性,可有效降低背景;但如果所識(shí)別的抗原表位被破壞，則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 多克隆抗體可識(shí)別多個(gè)抗原表位，通常具有更高的親和力，即使有少數(shù)幾個(gè)抗原表位被破壞，仍然不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
4、 孵育二抗特異性酶標(biāo)記的針對(duì)一抗抗體的二抗抗體和孵育一抗后的膜進(jìn)行孵育，膜上已和目 標(biāo)蛋白質(zhì)特異性的結(jié)合的一抗抗體和二抗抗體發(fā)生特異性的結(jié)合。 大多數(shù)一抗抗體的來源是小鼠或兔，因此抗鼠**球蛋白和抗兔**球蛋白是*常見的二抗抗體。山羊是*常見的用于生產(chǎn)多克隆抗小鼠和抗兔抗體的動(dòng)物，所以山羊抗鼠**球蛋白和抗兔**球蛋白是*常見的二抗抗體。選擇二抗抗體取決于一抗抗體的動(dòng)物來源。例如,如果一抗抗體是小鼠來源單克隆抗體,二抗抗體必須是抗小鼠的抗體；如果一抗抗體是兔來源多克隆抗體,二抗抗體必須是抗兔的抗體。 5、 蛋白檢測(cè)（顯色）和分析（1）蛋白檢測(cè)（顯色）：
酶標(biāo)記的二抗和合適的底物發(fā)生反應(yīng)，生成有顏色的產(chǎn)物，即可見的蛋白區(qū)帶，通過分析特異性反應(yīng)生成的可見蛋白區(qū)帶的位置和強(qiáng)度即可獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或（和）組織中表達(dá)情況的信息。 在酶標(biāo)二抗抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶(HRP)。堿性磷酸酶可以將無色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物；而辣根過氧化物酶可以H2O2為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產(chǎn)物或?qū)?-氯萘酚氧化成藍(lán)色產(chǎn)物。另一種檢測(cè)辣根過氧化物酶的方法是用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾（luminol，氨基苯二酰一肼）并發(fā)光，在化學(xué)增強(qiáng)劑存在下光強(qiáng)度可以增大1000 倍，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測(cè)辣根過氧化物酶的存在。 （2）結(jié)果分析：a對(duì)照設(shè)計(jì) 成功進(jìn)行Western Blot 檢測(cè)，設(shè)置合適正確的對(duì)照是必不可少的，只要正確設(shè)置了這些對(duì)照，即可快速和準(zhǔn)確的找到Western Blot 的問題所在，并保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性。 一般需要設(shè)置的對(duì)照如下：陽性對(duì)照：明確表達(dá)檢測(cè)蛋白的組織或細(xì)胞，用于檢測(cè)抗體的工作效率。 陰性對(duì)照：明確不表達(dá)檢測(cè)蛋白組織或細(xì)胞，用于檢測(cè)抗體的特異性。二抗對(duì)照：不加一抗，用于檢測(cè)二抗的特異性。 內(nèi)參對(duì)照：檢測(cè)標(biāo)本的質(zhì)量和二抗系統(tǒng)。 空白對(duì)照：不加一抗和二抗；用于檢測(cè)膜的性質(zhì)和封閉的效果。 b內(nèi)參內(nèi)參即是內(nèi)部參照，對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的 蛋白，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物。在Western Blotting 中使用內(nèi)參其實(shí)就是在**印跡過程中另外用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢測(cè)內(nèi)參，這樣在檢測(cè)目的產(chǎn)物的同時(shí)可以檢測(cè)內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個(gè)Western Blotting 顯色或者發(fā)光體系是否正常。 選擇內(nèi)參與要檢測(cè)的目的蛋白的分子量*好相差5KD以上。當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯，可同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)；當(dāng)目的蛋白 的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí)，可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體檢測(cè)，然后使用印跡膜再生液洗掉膜上的抗體，重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體檢測(cè)。
