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流式細(xì)胞術(shù)之補償調(diào)節(jié)

流式細(xì)胞儀是通過內(nèi)置的激光器發(fā)射激光激發(fā)熒光染料,即被488nm或其它特定波長的光激發(fā)后,發(fā)射出另一特定波長的發(fā)射光,并通過光電倍增管或光電二極管將光信號放大轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柣驍?shù)字信號,并由計算機統(tǒng)計處理為可讀數(shù)據(jù)。


用激光束激發(fā)兩種或兩種以上熒光染料而發(fā)出不同波長的熒光,從理論上講,可以選擇光學(xué)組件將它們分開,僅使一種熒光被一種熒光探測器收集處理,而檢測不到另外一種熒光。但實際上由于熒光素的發(fā)射波長是正態(tài)或偏正態(tài)曲線,即有很寬的范圍,熒光素之間的波譜常有重疊現(xiàn)象,如下圖1-1所示。由此,我們需要進行補償調(diào)節(jié),補償?shù)膹姸葘㈦S著各熒光探測器的放大倍數(shù)(電壓)的變化而變化,特定的電壓對應(yīng)特定的補償參數(shù)。

 


圖1-1  FITC和PE發(fā)射光譜

 

對于熒光補償?shù)拇_定,需運用以上補償?shù)幕驹聿⒔Y(jié)合特定的標(biāo)本來實現(xiàn)。以FITC,PE雙色分析為例:


(1)先調(diào)節(jié)陰性對照管:將原補償清零,首先調(diào)節(jié)電壓,通過調(diào)節(jié)電壓,使陰性群落在FITC和PE雙陰性區(qū)。


(2)FITC單染管:在理想情況下(沒有熒光干擾),因檢測管中不應(yīng)該出現(xiàn)PE信號,但實際情況是在FITC與PE的雙陽性區(qū)出現(xiàn)了熒光信號。這個信號就是PE探測器檢測到的FITC信號。此時需要通過調(diào)節(jié)補償參數(shù),取合適的補償強度來抵消PE中的信號。如下圖所示,調(diào)節(jié)補償(PE- %FITC ),使得兩群細(xì)胞FL2的Mean/Median值相同或相近,或通過經(jīng)驗判斷(原則為“橫平,豎直”)。當(dāng)PE探測器檢測到的FITC信號恰好完全消除時,即PE信號與陰性對照一樣時,PE對FITC的補償調(diào)節(jié)完成。


(3)PE單染管:同理,將進入FITC探測器的PE信號通過補償調(diào)節(jié)來消除。 


4)當(dāng)設(shè)置好以上補償條件后,即補償調(diào)節(jié)完畢。




1-2 FITCPE通道補償調(diào)節(jié)



圖1-3 補償不足和過補償?shù)碾p參數(shù)點圖

 

補償調(diào)節(jié)抗體的正確選擇對于熒光通道之間的補償調(diào)節(jié)是非常重要的。要求選擇的抗體所結(jié)合的抗原分子在樣本細(xì)胞中有明確表達,占樣品細(xì)胞的10%以上,50%以下。如果陽性細(xì)胞比例太低,在陽性細(xì)胞區(qū)域無法形成明顯的細(xì)胞團,無法判斷調(diào)節(jié)是否合適。如陽性細(xì)胞比例過高,則不表達該抗原的陰性細(xì)胞無法形成明顯的細(xì)胞團,如圖1-4直方圖所示。

圖1-4直方圖

滬公網(wǎng)安備 31011702004356號

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