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技術(shù)文章

**組化遇到的問題及其解決辦法（表）

**組化遇到的問題及其解決辦法（表）

1、染色過強(qiáng)：

原因

解決辦法

抗體的濃度過高或抗體孵育時間過長 降低抗體滴度（一般指濃縮性抗體）抗體孵育時間：室溫1小時或4℃過夜
孵育溫度過高，孵育溫度超過37℃ 一般室溫20-28℃
DAB顯色時間過長或DAB濃度過高 顯色時間不能超過5-10分鐘，以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)

2、非特異性背景染色：

原因

解決辦法

操作過程中沖洗不充分 每步?jīng)_洗3×5
組織中含過氧化物酶未阻斷 可再配置新鮮3%H2O2封閉，孵育時間延長
組織中含內(nèi)源性生物素 正常非**動物血清再封閉
血清蛋白封閉不充分 延長血清蛋白封閉時間

3、染色弱：

原因

解決辦法

抗體濃度過低，孵育時間過短 提高抗體濃度，孵育時間不能少于60分鐘
試劑超過有效使用期 及時更換試劑
操作中，滴加試劑時緩沖液未瀝干，致使試劑稀釋 每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液（但防止切片干燥）
室溫太低，低于15℃ 若室溫低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分鐘（或4℃冰箱過夜）
蛋白封閉過度 封閉時間不要超過10分鐘

4、染色陰性：

原因

解決辦法

操作步驟錯誤 重新試驗，設(shè)立陽性對照
組織中無抗原 設(shè)立陽性對照片，以驗證實驗結(jié)果
一抗與二抗種屬連接錯誤 仔細(xì)確定一抗與二抗種屬無誤

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