ELISA試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定的重復(fù)性差，這是什么原因造成的？

其實(shí)，這個(gè)問(wèn)題我們經(jīng)常遇到，試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定的重復(fù)性差，這是典型的由測(cè)定操作引起的問(wèn)題，常見(jiàn)原因如下：

a)可能原因：加樣本及試劑量不準(zhǔn)；孔間不一致；

解決方法：校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密。

重復(fù)某一樣品時(shí)，加樣時(shí)間盡可能與**次接近；

重復(fù)測(cè)定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；

樣品稀釋前應(yīng)充分混勻。

b)可能原因：加樣過(guò)快，孔間發(fā)生污染；

解決方法：重復(fù)測(cè)定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性；加樣不要過(guò)快。         

c)可能原因：加錯(cuò)樣本；

解決方法：檢查記錄和試劑，是否加錯(cuò)樣本。

d)可能原因：加樣本及試劑時(shí)，加在孔壁上部非包被區(qū)；

解決方法：加樣槍頭不要貼壁。

e)可能原因：不同批號(hào)試劑盒中組分混用；

解決方法：不同批號(hào)試劑盒中組分不可混用。

f)可能原因：溫育時(shí)間、洗板、顯色時(shí)間不一致；

解決方法：檢查時(shí)間是否一致。

g)可能原因：孔內(nèi)污染雜物；

解決方法：離心樣品，排除雜物。

h)可能原因：試劑/樣品沒(méi)有混勻；

解決方法：充分混勻樣品和試劑。

i)可能原因：血清標(biāo)本未完全凝固即加入，反應(yīng)孔內(nèi)出現(xiàn)纖維蛋白凝固或殘留血    

細(xì)胞，易出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)等。

解決方法：待血清標(biāo)本完全凝固后做試驗(yàn)。

在實(shí)驗(yàn)室，對(duì)試劑準(zhǔn)備一般不太注意，通常的做法是，在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來(lái)即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時(shí)間不夠的問(wèn)題，其直接的后果是對(duì)一些弱陽(yáng)性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。
    因此，在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備*為關(guān)鍵的是，在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來(lái)，在室溫下放置20min以上后，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度較快地達(dá)到所要求的高度，以滿足測(cè)定要求。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗(yàn)室使用時(shí)對(duì)所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。
此外，當(dāng)試劑盒以O(shè)PD為底物時(shí)，則底物溶液應(yīng)在反應(yīng)顯色前臨時(shí)配制。