一、**標記法及其分類
1.熒光**法
**熒光技術的實驗方法及其分類原理是應用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產(chǎn)物發(fā)出的熒光，熒光強度與Mb濃度呈正比，可在8min內(nèi)得出結(jié)果。結(jié)果以Mb每小時釋放的速率表示(△Mb)表示。該法重復性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、準確的特點。
以雙抗夾心法為例，首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。除去未結(jié)合抗體，然后加受檢標本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體復合物。洗滌除去未結(jié)合物，接著加入熒光標記的抗體，使之與抗原特異性結(jié)合，形成抗體—抗原—抗體復合物。*后根據(jù)熒光強度，即可對蛋白抗原進行定量。
傳統(tǒng)的熒光**法受本底熒光的干擾較大，時間分辨熒光**測定法是以具有特長壽命的稀土金屬如銪，作為標記物，加入正常液后激發(fā)測定，能有效去除短壽命本底熒光的干擾。
2.**熒光技術的實驗方法及其分類放射**法
放射**法是以過量的未標記抗原與放射性物質(zhì)標記的抗原，競爭性地與抗體結(jié)合，形成有放射性的抗原—抗體復合物與無放射性的抗原—抗體復合物，并有過剩的標記抗原與未標記的抗原。然后通過離心沉淀等方法，將抗原—抗體復合物與游離抗原分離，分別測定其放射性強度與標準曲線比較，即可對未標記的待測抗原進行定量。
RIA法測定血清蛋白靈敏度高、特異性強，可準確定量到ng／ml水平。但早期的方法操作麻煩，耗時長，且有放射性污染。近年來，隨著單克隆抗體的應用，RIA的靈敏度又有了較大提高，且操作大為簡化，并已有商品試劑盒供應，使用方便。
3**熒光技術的實驗方法及其分類.酶聯(lián)**法(ELISA)
ELISA法有競爭法和夾心法兩種。競爭法是基于標準或血清Mb和微孑L板上包被的Mb競爭性地與單克隆抗體相結(jié)合的原理而建立，該法的*低檢測限為10μg／L，線性范圍達1 000ug／L。夾心ELISA法與EIA具有良好的相關性(r＝0.92)。ELISA法具有靈敏度高，特異性強，精密度好，操作簡單，適用于多份標本的檢測，不需特殊儀器設備等優(yōu)點，易于推廣普及。但不適合急診的快速檢測。
以雙抗法為例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗與包被抗原形成抗原—抗體復合物。接著加入酶標二抗，形成抗原—抗體—抗體復合物。*后加入底物，由酶催化底物生成產(chǎn)物。通過產(chǎn)物的生成量即可對蛋白抗原進行定量。
4.偶聯(lián)生物素—親和素系統(tǒng)的酶免法
利用了一個親和素分子可以與4個生物素分子結(jié)合的特性，使傳統(tǒng)的靈敏度較高的酶免法的靈敏度又有明顯的放大作用。
5.時間分辨熒光**分析
時間分辨熒光**分析（Time resolved Fluor immunoassay，TRFIA）是一種非同位素**分析技術，它用鑭系元素標記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。
6.**熒光技術的實驗方法及其分類解離增強鑭系元素熒光**分析
解離增強鑭系元素熒光**分析（Dissociation Enhanced Lanthanide Fluor immunoassay DELFIA）是時間分辨熒光**分析中的一種。它用具有雙功能基團結(jié)構的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標記的抗體/抗原，經(jīng)過**反應之后生成**復合物。由于這種復合物在水中的熒光強度非常弱，因此加入一種增強劑，使Eu3 從復合物上解離下來，自由Eu3 同增強劑中的另一種螯合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團，這種分子團在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強的熒光，信號增強了百萬倍。因為這種分析方法使用了解離增強步驟，因此稱為解離增強鑭系元素熒光**分析。
二、熒光抗體染色方法及其分類
1.**熒光技術的實驗方法及其分類直接染色法
將標記的特異熒光抗體直接加在抗原標本上，經(jīng)一定溫度和時間的染色，洗去未參加反應的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下便可見到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結(jié)合物而發(fā)出的熒光。直接染色法的優(yōu)點是：特異性高，操作簡便，比較快速。缺點是：一種標記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應設陰、陽性標本對照，抑制試驗對照。
2.間接染色法
如果檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（**抗體）與抗原標本進行反應，作用一定時間后，洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體即抗球蛋白抗體（**抗體）與抗原標本反應，如果**步中的抗原抗體互相發(fā)生了反應，則抗體被固定或與熒光素標記的抗抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-抗抗體復合物，再洗去未反應的標記抗抗體，在熒光顯微鏡下可見熒光。在間接染色法中，**步使用的未用熒光素標記的抗體起著雙重作用，對抗原來說起抗體的作用，對**步的抗抗體又起抗原作用。如果檢查未知抗體則抗原標本為已知的待檢血清為**抗體，基他步驟和檢查抗原相同。
由于**球蛋白有種屬特異性，因此標記的抗球蛋白抗體必須用**抗體同種的動物血清球蛋白**其他動物來制備。
間接染色法的優(yōu)點是既能檢查未知抗原，也能檢查求知抗體；用一種標記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動物的抗體結(jié)合，檢查各種未知抗原或抗體，敏感性高。缺點是：由于參加反應的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結(jié)果有時較難，操作繁瑣，對照較多，時間長。間接法應設陰、陽性標本對照，還應設有中間層對照（即中間層加陰性血清代替陽性血清）。
3.抗補體染色法
抗補體染色法簡稱補體法，是間接染色法的一種改良法，首先由Goldwasser等建立。本法利用補體結(jié)合反應的原理，用熒光素標記抗補體抗體，鑒定未知抗原或未知抗體（待檢血清）。染色程序也分二步：先將未標記的抗體和補體加在抗原標本上，使其發(fā)生反應，水洗，然后再加標記的抗補體抗體。如果**步中抗原抗體發(fā)生反應，形成復合物，則補體便被抗原抗體復合物結(jié)合，**步加入的熒光素標記的抗補體抗體便與補體發(fā)生特異性反應，使之形成抗原-抗體-補體-抗補體抗體復合物，發(fā)出熒光。
抗補體染色法具有和間接法相同的優(yōu)點，此外，還有其獨特的優(yōu)點：即只需要一種標記抗補體抗體，便能檢測各種抗原-抗體系統(tǒng)。因為補體的作用沒有特異性，它可以與任何哺乳動物的抗原-抗體系統(tǒng)發(fā)生反應。它的缺點是參與反應的成分多，染色程序較復雜，比較麻煩。
除上述三種方法外，還有在此基礎上演變出的一些方法，如雙層法、夾心法、混合法、三層法、抗體-抗補體法等等
