區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞的方法

流式細(xì)胞分析時(shí)，樣本細(xì)胞中一般都含有一定量的死細(xì)胞，通過(guò)一定的方法可以減少樣本中死細(xì)胞的比例，但是完全去除樣本中的死細(xì)胞幾乎是不可能的。但流式分析的目標(biāo)為活細(xì)胞，因此流式分析時(shí)將死細(xì)胞當(dāng)作活細(xì)胞來(lái)分析，會(huì)嚴(yán)重影響流式分析的結(jié)果，通?？梢赃x擇熒光染料來(lái)標(biāo)記區(qū)分死活細(xì)胞的方法，下面介紹一些流式分析時(shí)區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法。

（1）對(duì)角線死細(xì)胞

通常都悉知對(duì)角線可以區(qū)分死細(xì)胞，那么為什么死細(xì)胞會(huì)聚集在對(duì)角線上呢？原因是死細(xì)胞也可以產(chǎn)生非特異性熒光，而且死細(xì)胞產(chǎn)生的非特異性的熒光要明顯強(qiáng)于活細(xì)胞，甚至強(qiáng)于熒光素產(chǎn)生的熒光信號(hào)。非特異性熒光的波長(zhǎng)是沒(méi)有選擇性的，不局限于某一波長(zhǎng)范圍，所以一般所有常用的熒光信號(hào)通道都能夠接收到死細(xì)胞產(chǎn)生的非特異性熒光信號(hào)，而且該信號(hào)在所有波長(zhǎng)范圍的熒光強(qiáng)度相差不多，各個(gè)熒光通道接收到的熒光強(qiáng)度都是處于同一個(gè)等級(jí)的。因此，在散點(diǎn)圖上死細(xì)胞是位于對(duì)角線上的，而且不同的死細(xì)胞，其非特異性熒光的強(qiáng)度不同，并且差異性強(qiáng)度很大，所以從整體來(lái)看，死細(xì)胞的非特異性熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)從低到高的連續(xù)性分布，表現(xiàn)在散點(diǎn)圖上死細(xì)胞剛好處于對(duì)角線上，如圖1-A所示呈線性，與活細(xì)胞群體的圓形分布有明顯的區(qū)別，因此我們可以根據(jù)死細(xì)胞這一特性區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。

圖1：對(duì)角線死細(xì)胞流式圖

雖然死細(xì)胞位于散點(diǎn)圖的對(duì)角線上，但是對(duì)角線上的細(xì)胞確不一定是死細(xì)胞，因?yàn)殡p陽(yáng)性細(xì)胞如果在x軸和y軸的熒光信號(hào)相似時(shí)，也可以位于對(duì)角線上。所以，散點(diǎn)圖對(duì)角線上的細(xì)胞可能是死細(xì)胞，也可能是雙陽(yáng)性細(xì)胞。如圖1-B所示，樣本細(xì)胞為正常小鼠脾臟細(xì)胞，標(biāo)記 FITC-抗CD3抗體和PE-抗CD4抗體，F(xiàn)ITC和PE雙陽(yáng)性的CD4 T細(xì)胞和死細(xì)胞混在一起，無(wú)法區(qū)分。但是死細(xì)胞和雙陽(yáng)性細(xì)胞的形狀是不一樣的，死細(xì)胞呈現(xiàn)連續(xù)的線型分布，而雙陽(yáng)性細(xì)胞群呈現(xiàn)圓形的群體分布，因此，可以從對(duì)角線上的細(xì)胞群體的形狀大致判斷細(xì)胞的性質(zhì)。雖然不能根據(jù)熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱來(lái)區(qū)分該熒光信號(hào)是來(lái)自于死細(xì)胞的非特異性熒光還是來(lái)自熒光素產(chǎn)生的熒光，但是可以利用在散點(diǎn)圖上死細(xì)胞位于對(duì)角線的特點(diǎn)來(lái)區(qū)分死細(xì)胞和陽(yáng)性活細(xì)胞。如圖1-C所示，x軸表示FITC通道（樣本細(xì)胞標(biāo)記有FITC-抗CD3抗體），y軸表示APC通道（閑置通道），借用該散點(diǎn)圖可以明確區(qū)分圖1-B中無(wú)法區(qū)分的死細(xì)胞和雙陽(yáng)性細(xì)胞。此時(shí)只需要將排除了死細(xì)胞后的CD3 T細(xì)胞設(shè)門(mén)，將門(mén)內(nèi)的細(xì)胞顯示于新的FITC-PE散點(diǎn)圖中，如圖1-D，此時(shí)該散點(diǎn)圖內(nèi)的細(xì)胞都是活細(xì)胞，因?yàn)闃颖炯?xì)胞同時(shí)標(biāo)記有PE-抗CD4抗體，所以圖中的細(xì)胞明顯分為兩群，雙陽(yáng)性的是CD4T細(xì)胞，單陽(yáng)性的是CD8 T細(xì)胞。

（2）PE-Cy5通道非標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞

PE-Cy5通道（通常是FL3，接收的熒光波長(zhǎng)范圍大致為655-685nm）有時(shí)可用于識(shí)別死細(xì)胞，但首先該通道必須是閑置的通道，及樣本細(xì)胞中沒(méi)有標(biāo)記該通道代表的熒光素（PE-Cy5、PerCP等）偶聯(lián)抗體。選擇PE-Cy5-SSC散點(diǎn)圖，一般可看到不成群的PE-Cy5陽(yáng)性細(xì)胞，這些陽(yáng)性細(xì)胞的SSC值也是散在分布的，這些散在的PE-Cy5通道非標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞，即圖2-A中的紅色部分，將這部分細(xì)胞設(shè)門(mén)顯示于FITC-PE散點(diǎn)圖中，如圖2-B所示，這部分PE-Cy5通道非標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞基本都位于對(duì)角線部分，而對(duì)角線細(xì)胞一般為死細(xì)胞，所以散在的PE-Cy5通道非標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞一般就是死細(xì)胞。

圖2 PE-Cy5通道非標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞

因此利用PE-Cy5通道非標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞時(shí)，可以先在FSC-SSC圖中選擇目標(biāo)所在的細(xì)胞群，將其設(shè)門(mén)，然后將門(mén)內(nèi)的細(xì)胞顯示于PE-Cy5-SSC散點(diǎn)圖中，排除PE-Cy5通道非標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞代表的死細(xì)胞，將PE-Cy5陰性細(xì)胞設(shè)門(mén)，然后將門(mén)內(nèi)的細(xì)胞顯示于新的流式圖內(nèi)分析，這是該流式圖內(nèi)的細(xì)胞都是活細(xì)胞，分析或者分選時(shí)就可以盡量排除死細(xì)胞的干擾了。

以上兩種排除死細(xì)胞的方法只是一種經(jīng)驗(yàn)的方法，一般在實(shí)驗(yàn)要求不高或者預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)使用，流式分析時(shí)可以借鑒這兩種方法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞，但是不能將這兩種方法作為區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法，使用死活細(xì)胞染料，例如常見(jiàn)的7-AAD，PI和Zombie Dyes系列等才是標(biāo)記死活細(xì)胞的正確方法。

(3) 7-AAD、PI標(biāo)記死細(xì)胞

7-AAD（7氨基放線菌素D）與PI（碘化丙啶）是經(jīng)典的核酸標(biāo)記染料，在流式細(xì)胞術(shù)中能夠用于標(biāo)記死細(xì)胞，以排除死細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。7-AAD的熒光信號(hào)被PerCP通道接收，所以7-AAD不能與PerCP或PE-Cy5偶聯(lián)的抗體共同標(biāo)記樣本細(xì)胞。但其發(fā)射的熒光波長(zhǎng)基本不與PE發(fā)射的熒光重疊，因此可以與和PE共同標(biāo)記樣本細(xì)胞。而PI染料被激發(fā)后發(fā)射的熒光波譜范圍很大，常規(guī)FL2、FL3都能接收到其熒光信號(hào)，并且與PE、PerCP、PE/Cy5熒光素發(fā)射的熒光波長(zhǎng)有很大程度的重疊，因此PI染料不宜與這些染料共標(biāo)記。

7-AAD、PerCP、PE、PI、PE/Cy5發(fā)射光譜：

（4）Zombie Dyes標(biāo)記死細(xì)胞

當(dāng)流式檢測(cè)只分析細(xì)胞表面抗原分子，且不對(duì)樣本固定時(shí)，7-AAD和PI是比較理想和經(jīng)典的方法。但是如果需要分析細(xì)胞內(nèi)的分子，如檢測(cè)胞內(nèi)細(xì)胞因子、胞內(nèi)活化的激酶和核內(nèi)分子等需要固定樣本細(xì)胞，在胞膜上打孔，使熒光素偶聯(lián)抗體能夠通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與相應(yīng)目標(biāo)分子結(jié)合，這時(shí)7-AAD與PI就無(wú)法鑒別死細(xì)胞和活細(xì)胞了。

圖為：體外培養(yǎng)**的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞做Annexin V/PI染色的流式數(shù)據(jù)。其中，左邊為未經(jīng)固定處理的細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)結(jié)果；右邊為經(jīng)過(guò)70%EtOH, 1.5%PFA固定處理的細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)結(jié)果。

圖為：體外培養(yǎng)**的C57BL/6小鼠脾細(xì)胞做Annexin V/7-AAD染色的流式數(shù)據(jù)。其中，左邊為未經(jīng)固定處理的細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)結(jié)果；右邊為經(jīng)過(guò)70%EtOH, 1.5%PFA固定處理的細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)結(jié)果。

Zombie Dyes有別于PI和7-AAD等DNA染料，它是一種可用于需固定細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的染料，通過(guò)與細(xì)胞上蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。因活細(xì)胞可排除染料，所以僅細(xì)胞膜被著色；而死細(xì)胞的細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)均被著色，繼而根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)區(qū)分死/活細(xì)胞。而且Zombie Dyes可選擇性多，可以由不同的激發(fā)光激發(fā)，便于靈活選擇。